云南紅豆杉(TaxusyunnanensisChengetLu)別稱紫杉、赤柏松，屬紅豆杉科喬木，產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部，是生產(chǎn)紫杉醇的重要樹種[1-3]。云南紅豆杉是集用材、藥用、綠化于一體的珍貴樹種，特別是其紫杉醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他紅豆杉樹種[4]。紫杉醇具有抗癌活性，云南紅豆杉的野生資本比較少，人工培育紅豆杉是現(xiàn)在獲取紫杉醇較可行、有用的途徑[1，5]。為了更好地保護(hù)野生云南紅豆杉野生資本，大力培育后續(xù)產(chǎn)業(yè)，以滿足市場對云南紅豆杉資本的需求，近年來在云南麗江、大理、楚雄和丘北等地成立了云南紅豆杉人工栽植林。由于云南紅豆杉的普遍種植，病害發(fā)生嚴(yán)重，尤其是云南紅豆杉葉片葉斑病現(xiàn)象日趨普遍，影響了樹勢生長及藥用、觀賞價值。星散與判定病原菌是開展云南紅豆杉抗病防治研究的基礎(chǔ)。本試驗從自然感病的云南紅豆杉上星散純化得到1株對云南紅豆杉具有寄生作用的真菌，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀測與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方式，對云南紅豆杉葉斑病病原菌舉行了判定，并依據(jù)其形態(tài)特點與培育性狀舉行了開端研究，為云南紅豆杉葉斑病的防治奠基了基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步了解該病害的發(fā)病紀(jì)律提供了一定的理論依據(jù)。
1質(zhì)料與方式
1.1病原菌的星散
云南紅豆杉葉斑病葉片采自云南省楚雄市西山，用組織星散法星散病原菌，經(jīng)科赫氏法判定其為云南紅豆杉葉斑病的病原，菌株編號為hongdoushan02。
1.2病原菌的判定
1.2.1形態(tài)學(xué)判定利用顯微鏡觀測純化星散到的病原菌，并對其舉行形態(tài)判定。
1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分解用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，舉行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反映系統(tǒng)總體積25μL，反映各因素終濃度為：Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反映緩沖液。PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃復(fù)性45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)品送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采取NJ法舉行系統(tǒng)分解，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.3生物學(xué)特征研究[6-7]
1.3.1不同碳源和氮源對菌落生長的影響
以察氏培育基為基礎(chǔ)培育基，劃分以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；劃分以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、卵白胨取代氮源。每種培育基中劃分接種直徑為5mm的菌塊，25℃恒溫漆黑培育，5d后用“十”字交織法測量菌落直徑。每個處理設(shè)3個重復(fù)。
1.3.2不同溫度對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培育基中心，劃分在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃漆黑下恒溫培育，5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培育條件同菌落培育，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個孢子。每個處理設(shè)3個重復(fù)。
1.3.3不同pH值對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
將高壓滅菌后的察氏培育基pH值劃分調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板，取直徑5mm的菌塊接種于察氏培育基中心，漆黑條件下25℃培育5d后測量菌落直徑。用0.2mol/L磷酸氫二鈉和0.2mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25℃恒溫箱漆黑培育，24h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個孢子。每個處理設(shè)3個重復(fù)。
1.3.4不同光照處理
取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培育基中心，劃分置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h漆黑環(huán)境中，25℃培育5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培育條件同菌落培育，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個孢子。每個處理設(shè)3個重復(fù)。
1.4不同殺菌劑對菌落生長的影響
將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋，每10mL培育基中加入1mL藥液制成含藥液的平板，比較組加入等量無菌水。取5mm菌塊置于察氏培育基平板中心，25℃漆黑培育5d后測量菌落直徑。每個處理設(shè)3個重復(fù)。
2效果與分解
2.1云南紅豆杉病原菌的判定
2.1.1形態(tài)學(xué)判定
該病重要發(fā)生在葉部，發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)多個黃褐色病斑，病斑邊緣玄色，隨著病情的生長，可延伸至整個葉片，使葉片枯萎死亡。在PDA培育基上，28℃培育6d菌落直徑達(dá)4cm，菌落青灰色相間，圓形、規(guī)則，邊緣整齊，菌絲絮狀，培育一段時間后可看到培育皿蓋上有水珠；后頭輪紋狀，中心圓褐色，外圍一環(huán)黃色；菌落生長緩慢(圖1)。菌絲有隔，淡褐色，產(chǎn)孢細(xì)胞孔生式產(chǎn)孢，合軸式延伸或有時不再延伸；分生孢子多串生(向頂系列)，有的單生，卵形或倒棍棒形，具喙，淡橄欖褐至橄欖褐色或褐色，滑膩，具橫隔膜及縱向隔膜，大小(2.4～6.2)μm×(2.9～7.1)μm(均勻2.65μm×6.65μm)。分生孢子頂端或喙部，?？咨桨l(fā)生新的分生孢子，云云聯(lián)系發(fā)生，形因素枝或不分枝的孢子鏈(圖2、圖3)。